华东理工刘润辉教授课题组 Adv. Sci.：无规共聚物模拟纤连蛋白实现普适性结合生长因子的功能

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蛋白是生命活动的重要功能载体，一般依据其特定氨基酸序列可通过生物合成或者多肽化学合成制备；也可以天然蛋白的氨基酸序列为模板，通过调整某些氨基酸进行蛋白改造和蛋白模拟。是否能够不依赖天然蛋白的氨基酸序列模板，通过无规共聚物模拟蛋白并实现高效和普适性的蛋白-受体相互作用？

近日，华东理工大学刘润辉教授课题组在无规聚合物模拟具有特定氨基酸序列和结构的蛋白研究领域取得突破，以氨基酸无规共聚物模拟细胞外基质中的纤连蛋白，实现了高效和普适性地与各类生长因子结合的功能。该成果以“Statistic Copolymers Working as Growth Factor-Binding Mimics of Fibronectin”为题发表在《Advanced Science》（Adv. Sci. 2022, DOI: 10.1002/advs.202200775）。

生长因子是一类通过与细胞表面受体结合调控细胞行为从而具有组织再生功能及生物调节功能的细胞因子，在生物系统中发挥着重要作用。但生长因子在体内易被蛋白酶解，从而迅速失活，因此在临床应用中生长因子的剂量急剧增加，这导致了成本升高和严重副作用。在生理条件下，细胞外基质中的纤连蛋白可直接与生长因子结合，以储存的方式保护生长因子免受蛋白酶降解，调控生长因子释放的时间及空间。此外，纤连蛋白结合的生长因子仍能与它们的受体结合，从而阻止细胞内吞并延长细胞内信号传导。受纤连蛋白的生长因子结合功能启发，通过无规共聚物去模拟具有特定序列和结构的纤连蛋白，设计并获得了可高效模拟纤连蛋白普适性结合生长因子功能的氨基酸无规共聚物（图1）。优选聚合物与生长因子的结合能力已经接近于纤连蛋白与生长因子的结合能力。这一设计思路打破了传统模拟功能蛋白与受体蛋白相互作用依赖天然蛋白氨基酸序列模板，通过蛋白片段或者经氨基酸替换或者改造的序列可控多肽模拟蛋白的设计思路，摆脱了对原有功能蛋白中氨基酸序列模板的依赖，可实现快速构建功能蛋白模拟聚合物及实现与受体蛋白的高效结合，并展示相应的生物学功能。

图1 模拟细胞外基质中纤连蛋白设计合成的无规共聚物通过高通量筛选出可普适性结合多种生长因子的优选共聚物，实现无规共聚物表现出具有特定序列和结构蛋白的生物功能。

本研究中，他们根据纤连蛋白中生长因子结合域的结构及功能特征，设计了一系列具有不同正电荷和疏水性亚基种类及比例的无规共聚物，通过免疫荧光高通量筛选了无规共聚物对于来自转化生长因子-β（TGF-β）家族的骨形态发生蛋白-2（BMP-2）和转化生长因子-β1（TGF-β1），来自血小板衍生生长因子（PDGF）家族的PDGF-AA和PDGF-BB，来自成纤维生长因子（FGF）家族的FGF-10和FGF-21，来自表皮生长因子（EGF）家族的EGF以及来自纤溶酶原相关生长因子家族的肝细胞生长因子（HGF）这些来自不同生长因子家族的多种生长因子的结合功能（图1）。最终优选出可高效结合各种生长因子的无规共聚物。

图2 优选无规共聚物与代表性生长因子的亲和力与纤连蛋白与生长因子的亲和力相近。

通过表面等离子共振测试得到优选聚合物与生长因子的亲和力可达到nM级别，与文献中纤连蛋白的亲和力类似（图2）。此外，选择生化实验中广泛应用的牛血清白蛋白（BSA）作为对照组，优选聚合物与其并没有任何亲和力，证明优选聚合物是通过模拟纤连蛋白特异性的与纤连蛋白结合生长因子实现特异性作用，而非与所有蛋白均具有亲和力。 

图3 通过计算机模拟优选共聚物相同链长与亚基种类和比例的多肽与代表性生长因子（骨形态发生蛋白-2）的结合模式

为了进一步研究优选聚合物与生长因子的结合模式，他们合成了与优选聚合物具有相同链长、相同亚基种类和比例的多肽。这种多肽与生长因子的亲和力与优选共聚物的相类似，因此作为模型多肽通过计算机模拟去研究其与生长因子的结合模式（图3）。最后发现多肽与纤连蛋白均是与以二硫键连接的二聚体骨形态发生蛋白-2的“手指”区域（‘finger’ region）相结合，与生长因子的两条链均发生相互作用。

  
图4 优选的多肽共聚物通过简便方法接枝到商用的明胶海绵上可有效促进生长因子即BMP-2体内外的成骨活性。

他们通过优选聚合物上的氨基与商用明胶海绵上的羧基反应，一步法将优选共聚物接枝到明胶海绵支架上。优选共聚物修饰后的明胶海绵支架可有效阻止生长因子的突释，在低BMpP-2促进体外细胞的成骨分化以及体内异位骨组织的生成。实验结果表明优选共聚物可有效维持生长因子在体内外的生物活性。

华东理工大学博士后张雯静是该论文的第一作者，刘润辉教授为通讯作者。该成果得到了国家自然科学基金委等基金的资助。

论文链接: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202200775

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